Au lendemain de la Conquête, l’oppidum gaulois va progressivement se transformer en capitale de cité romaine. Durant l’époque augustéenne (27 avant notre ère à 14 de notre ère), et jusque dans les années 30 de notre ère, la ville change peu d’aspect, le murus gallicus est présent et l’habitat privé conserve les techniques de construction en terre et bois. La romanisation de l’urbanisme et de l’architecture s’engage dans la première moitié du I^er siècle. Dès cette période, l’ambitieux programme de construction des aménagements publics et des bâtiments qui abritent les institutions va donner une impulsion aux projets privés. Les caractéristiques des domus les plus riches démontrent l’assimilation des pratiques romaines par les dirigeants locaux, autant à travers l’architecture, le type de plan adopté et les techniques de construction mises en œuvre que pour la décoration. La ville s’étend alors sur les 120 hectares délimités par la boucle du Doubs. Elle décline durant la seconde moitié du III^e siècle, même si elle devient la métropole de la Provincia Maxima Sequanorum sous l’empereur Dioclétien.

Voici la description que l’empereur Julien faisait de Besançon en l’an 361 : « Dès que je fus empereur, après avoir fait campagne contre les Barbares – campagne qui dura trois mois –, en revenant voir les rivages gaulois, je me mis à faire des recherches […]. [Besançon est] maintenant une petite ville repliée sur elle-même, mais autrefois elle était grande et parée de monuments luxueux, puissante par son enceinte et de plus par la nature même du site ; le Doubs en effet l’entoure et elle se dresse comme un promontoire dans la mer, inaccessible pour ainsi dire aux oiseaux eux-mêmes, sauf aux endroits que la rivière en l’entourant laisse comme des plages avancées […] (Julien, lettre n° 26, éditions J. Bidez, Paris, 1933).

L’archéologie fournit peu d’informations sur la ville du Bas-Empire. De rares indices du IV^e siècle ont été observés à la ZAC Pasteur et au Refuge, sur une domus antique abandonnée. On peut légitimement penser que la ville continue de vivre sur l’héritage de l’Antiquité, bien qu’elle soit devenue « une petite ville repliée sur elle-même », selon le témoignage de l’empereur Julien. Elle est sans doute concentrée au pied de la colline de la citadelle, où se développe le groupe épiscopal protégé par une enceinte, castrum auquel fait sans doute pendant un castrum civil devant le pont romain. L’introduction du christianisme en Gaule, religion officielle de l’Empire romain depuis 313, remodèle la ville. On peut dater l’existence de structures religieuses à Besançon au plus tard du IV^e siècle, à l’époque de Pancharius, premier évêque pour lequel on dispose de documents écrits, vers 345. Au V^e siècle, la ville fait partie du royaume burgonde. Un récent diagnostic en bord de rivière (site des 5, rue du Porteau et 27, avenue de la Gare d’Eau) a livré des constructions datées des VI^e et VII^e siècles, des murs en pierres sèches fondés sur des maçonneries du Haut-Empire.